Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Исследуемый раствор. Достаточное количество исследуемого вещества, растворяют в указанном в частной статье буферном растворе для получения раствора с концентрацией в пределах интервала стандартного графика. При указанном буферном растворе раствор имеет рН от 10,0 до 10,5.
Стандартные растворы. Стандартное вещество, предназначенное для определения белка, растворяют в буферном растворе, используемым для приготовления исследуемого раствора. Данный раствор разводят порционно одинаковым буферным раствором, чтобы получить не менее пяти стандартных растворов с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале между 5 мкг/мл и100 мкг/мл.
Контрольный раствор. Используют буферный раствор, применяемый для приготовления исследуемого раствора и стандартных растворов.
Реактив меди сернокислой. В дистиллированной воде Р растворяют 100 мг меди (II) сульфатаР и 0,2 г натрия тартрата Р в воде дистиллированной Р и доводят объем до 50 мл тем же растворителем. Растворяют 10 г натрия карбоната безводного Р в воде дистиллированной Р и доводят объем до 50 мл тем же растворителем. Медленно вливают раствор натрия карбоната в раствор меди сернокислой, помешивая. Раствор используют в течение 24 часов.
Реактив щелочной меди. Смешивают 1 объем реактива меди сернокислой, 2 объема 50 г/л раствора натрия додецил сульфата Р и 1 объем раствора 32 г/л натрия гидроксида Р. Хранят при комнатной температуре и используют в течение 2 недель.
Разведенный фосфомолибденовольфрамовый реактив. Смешивают 5 мл фосфомолибденовольфрамового реактива Р с 55 мл воды дистиллированной Р. Хранят в контейнере темного стекла при комнатной температуре.
Методика. К 1,0 мл каждого стандартного раствора, исследуемого раствора и контрольного раствора прибавляют 1,0 мл реактива щелочной меди и смешивают. Дают отстояться в течение 10 мин. Затем прибавляют 0,5 мл разведенного фосфомолибденовольфрамового реактива, смешивают и дают отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин. Определяют оптическую плотность (2.2.25) раствора при длине волны 750 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения.
Расчеты. Зависимость оптической плотности от концентрации белка не является линейной, тем не менее, если диапазон концентраций, используемый для построения стандартного графика небольшой, он близок к линейности. Строят графическую зависимость оптической плотности стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения стандартного графика. На основании стандартного графика и оптической плотности определяют концентрацию белка в исследуемом растворе.
Интерферирующие субстанции. В представленной процедуре перед началом определения дезоксихолево-трихлоруксусная кислота добавляется в исследуемую пробу для удаления интерферирующих веществ. Данная методика может быть применена для концентрирования белков из разведенного раствора. Добавляют 0,1 мл раствора 1,5 г/л натрия дезоксихолата Р к 1 мл исследуемого вещества. Используя миксер, перемешивают раствор и дают отстояться при
комнатной температуре в течение 10 мин. Добавляют 0,1 мл раствора 720 г/л трихлоруксусной кислоты Р и перемешивают миксером. Центрифугируют при ускорении 3000 g в течение 30 мин, декантируют и удаляют остаточную жидкость пипеткой. Повторно разводят полученный осадок в 1 мл реактива щелочной меди.
МЕТОД 3
Данный метод (известный как метод Бредфорд) основан на абсорбционном сдвиге с длины волны 470 нм до 595 нм, наблюдаемом при связывании белков красителем кислотным синим 90. Краситель кислотный синий 90 связывает наиболее активно аргининовые и лизиновые остатки в белке, что может приводить к погрешности при исследовании различных белков. Белки, используемые в качестве стандартного вещества, должны быть такими же, как и белки, предназначенные для исследования. Следует избегать детергентов и амфолитов в исследуемом образце. Высоко щелочные пробы могут взаимодействовать с кислотными реагентами.
Для приготовления всех буферных растворов и реактивов, применяемых в данном методе, используют воду дистиллированную Р.
Исследуемый раствор. Для получения раствора с концентрацией в пределах интервала стандартного графика растворяют достаточное количество вещества, предназначенного для исследования в указанном в частной статье буферном растворе.
Стандартные растворы. Растворяют стандартное вещество,
предназначенное для определения белка в том же буферном растворе, что и исследуемый раствор. Разводят порционно данный раствор этим же буферным раствором, чтобы получить не менее пяти стандартных растворов с концентрациями белка, равномерно распределенными в интервале между 0,1 мг/мл и 1 мг/мл.
Контрольный раствор. Используют буферный раствор, применяемый для приготовления исследуемого раствора и растворов сравнения.
Реактив кислотный синий 90. Разводят 0,10 г реактива кислотного синего 90 Р в 50 мл спирта 96% (об/об) Р. Добавляют 100 мл кислоты фосфорной Р, доводят раствор до 1000 мл водой дистиллированной Р и перемешивают. Фильтруют раствор и хранят в контейнере темного стекла при комнатной температуре. При хранении выпадает осадок красителя, поэтому перед использованием реактив необходимо профильтровать.
